诱导原生质体融合的方法

诱导原生质体融合的过程中可用的方法有三种：物理法、化学法、生物法。

将不同植物体细胞放在一起培养，必须通过一定的技术手段进行人工诱导。诱导方法有物理法和化学法两大类。

物理法就是利用离心、振动、电刺激等促使原生质体融合；化学法是用聚乙二醇等试剂作为诱导剂诱导细胞的原生质体融合，聚乙二醇简称为PEG；诱导动物细胞融合时还可以用生物法，即用灭活的病毒进行诱导，重压不能促使原生质体的融合。

植物体细胞杂交,又称原生质体融合是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。

原生质体融合的原理

两个具有不同遗传性状的细胞，采用适宜的水解酶溶解细胞壁后，在自发情况或融合剂作用下，两个原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，并在适宜的条件下再生出细胞壁，对重组体进行生产性能、生理生化和遗传特性分析获得所需重组子。其中，细胞在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象又称自发融合；而分离原生质体以后，通过加入诱导剂或利用其他方法诱导不同亲本原生质体发生融合的过程又称诱导融合。理论上讲原生质体融合可在包括种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体间进行，它不仅可以突破物种间的生殖隔离，创造远缘杂种；还可以使双亲的细胞质基因结合在一起，从而达到改良由胞质基因控制的性状的目的。

原生质体融合前要检查什么

原生质体融合前要检查原生质体的活性。原生质体融合(protoplastfusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。原生质体融合前检查原生质体的活性是必不可少的步骤。

什么叫原生质体融合,他的基本操作是怎样的,此法在育种工作中有何重要性?

原生质体是去掉细胞壁的植物细胞，原生质体融合就是植物细胞的融合。常用的方法有振动，电击，离心，聚乙二醇（PEG）处理等。先用纤维素酶和果胶酶处理原植物细胞，得到原生质体再在培养液中使用上述方法进行融合。这种方法的原理是细胞的流动性。当细胞核完成融合，并且重组细胞重生出细胞壁后，就表明杂种细胞已成功得到。之后利用植物的组织培养技术用得到的细胞就可以培养出完整个体，得到一株具有新形状的植物个体。

原生质体融合 原生质体融合前要让什么失活

植物细胞融合技术的发明打破了生物物种之间的界限，克服了远缘杂交不亲和的问题，为培养兼有两种物种优良性状的新物种提供了可能。不过由于人类还不完全了解遗传物质的调控机理，一些杂种植物并不能按人们希望的那样表达性状。

希望楼主采纳，这些字是我一个一个敲的。

什么是原生质体融合技术

原生质体融合(protoplast fusion)指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。

原生质体融合 原生质体融合前要让什么失活

意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。

原生质体融合的步骤

原生质体融合的程序包括：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备和再生（过程见8.1.1）；③原生质体的融合；④融合子遗传标记的筛选；⑤融合子的鉴定。

原生质体融合 原生质体融合前要让什么失活

8.2.2.1 标记菌株的筛选

进行原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于融合后重组子的筛选。常用营养缺陷型和抗性作为遗传标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态作为遗传标记。遗传标记的选择要根据实际实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷型或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷型标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生质体的融合

原生质体融合就是把亲株的原生质体在高渗条件下进行混合。在原生质体融合中，诱导融合的方法主要有化学法（PEG促融法）、物理法（包括电融合和激光诱导融合法等）。

仅仅将原生质体等量地混合在一起融合频率通常是很低的，只有通过加入融合剂例如表面活性剂聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如电击和激光诱导等，融合频率才会提高。

（1）PEG促融法：其诱导融合的可能机制是PEG带有负电荷的醚键，与带负电荷的原生质体相遇后，在Ca2+等阳离子作用下形成共同的静电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。在有钙离子存在的条件下融合时为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为pH值能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常采用30%～40%。由于PEG的加入，原生质体间的黏着强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合时间不宜过长。

（2）电融合法：其原理是在短时间强电场的作用下，当原生质体被置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体，使原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串，原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了PEG融合的随机过程。该法的优点是融合频率高，无化学毒性，操作简便，可在显微镜下进行，具有极强的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光照射接触处，从而使质膜击穿或产生微米级的微孔，质膜上产生微孔是一个可逆的过程，质膜恢复的过程中细胞连接微孔的表面曲率很高，使细胞处于高张力状态，此时细胞由哑铃形逐渐变为圆球状，进而细胞发生融合。该法的优点是毒性小，损伤小，具高度选择性；缺点是操作技术难度大，所需设备昂贵复杂，因此很难被推广应用。

8.2.2.3 融合子遗传标记的筛选

原生质体融合后，融合子的选择方法是使原生质体融合技术得以应用的关键。以A和B细胞融合来说，可能会形成AA，AB及BB 三种融合形式。而要筛选出的是AB，即具有A细胞核B细胞的两个遗传标记就可以确定其为融合子。因此，就可以通过A和B细胞所分别具有的选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者则是不稳定的，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态转接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。融合子的筛选是融合过程的关键。下面列举几种常见的筛选方法。营养缺陷型标记筛选融合子、抗药性标记筛选融合子、荧光色素标记筛选融合子、灭活原生质体标记筛选融合子、利用双亲对碳源利用不同而筛选融合子和利用某些特殊生理特征作为标记筛选融合子等方法筛选。

8.2.2.4 融合子的鉴定

融合子筛选出后，还要对其进行鉴定。常用的鉴定方法有菌体或孢子形态、大小的比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，DNA含量的比较，对结构蛋白及非基因直接编码的次生代谢产物的分析，对染色体稳定性的研究等。刘玲等（2007）采用酯酶同工酶电泳对f1和f2融合子进行鉴定，融合子有不同于亲本的新酶带出现，融合子菌落呈现新的性状，菌落形态、颜色、菌丝形状都与亲本部分性状相似，又存在差异，并且菌株生长速度也不同于双亲本，在生理生化性状上与亲本存在明显的差异，这说明融合子f1、f2是融合双亲性状的新菌株。